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                液相實戰丨HPLC分析方法的建立

                2023-09-11 15:36:33  來源: 色譜學堂

                上周,我們“分不開怎么辦”欄目收到了一位王同學的咨詢,她在人參皂苷類化合物分析方面遇到了一些困難:




                ?
                 王同學目前所做的嘗試



                1. 使用T家C18柱,Rg1和Re未實現基線分離(分離度R<1.5);

                2. 更換色譜柱為A家C18,在相同條件下,同樣未實現Rg1和Re的基線分離;

                3. 在A家C18色譜柱的基礎上,調整流動相梯度,Rg1和Re可以滿足基線分離,但是其他人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc和Rd)分離不理想。


                王同學的訴求是尋找一個合適的HPLC分析方法(包括色譜柱和流動相),能夠實現樣品中所有人參皂苷的良好分離( Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1)。










                收到問題后,我們的“大師兄”團隊立即聯系了王同學,針對她的訴求提出了一些建議。


                王同學的這個案例很有代表性,因此今天我們就以這個案例為例,和大家分享一下在做HPLC分析方法開發時的思路和心得。


                通常來說,建立合適的HPLC分析方法,你需要:


                01

                確定分離目標,明確方法要求;

                02

                解析目標分析物,包括化合物結構、分子量、吸收光譜、pKa和化學穩定性等方面信息;

                03

                對收集到的信息進行綜合分析和考慮,選擇合適的色譜柱(固定相),設計合適的實驗條件;

                04

                使用挑選的色譜柱和實驗條件進行分析,根據結果調整色譜柱和實驗條件;

                05

                在合適的色譜柱和實驗條件下,進行相關驗證,最終得到穩定靠譜的實驗方法。



                針對今天的案例,我們一條條看:


                01
                分離目標和方法要求


                首先,我們明確這個實驗的目的是通過合適的HPLC方法實現人參皂苷化合物 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的分離。

                02
                解析目標分析物


                建立合適的人參皂苷HPLC分析方法,需要進行全方位的考慮,其中化合物結構是至關重要的點。


                人參皂苷( Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1等 )是人參的主要成分,都具有相似的基本結構:含有由30個碳原子排列成四個環的甾烷類固醇核。



                它們都具備以下特點:


                1. 化合物偏中性,具備一定的疏水性;

                2. 不同化合物之間的差異在于糖分子的種類和數量,結構比較接近,甚至屬于同分異構體;

                3. 分子量在800-1200,分子結構偏大(小分子領域)。


                03
                選擇色譜柱和實驗條件


                根據人參皂苷化合物的這些特點,我們確定了建立HPLC方法的要點:




                1. 偏中性化合物,流動相可以采用非緩沖的水溶液,甚至純水相;

                2. 具備一定疏水性的結構相近化合物,色譜柱考慮采用C18固定相,使用等度或緩梯度;

                3. 分子物理尺寸偏大,孔徑在分離中有可能發揮重要作用,需要仔細考察此點。


                04
                調整色譜柱和實驗條件


                2020版中國藥典人參的含量測定項規定的色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。


                但是中國藥典方法中并沒有明確色譜柱的細節,包括色譜柱規格、固定相粒徑和孔徑,而這些往往會影響分離效果。


                我們先按照該方法,使用相同規格的不同孔徑ChromCore 120 C18(120 ?)和ChromCore C18 (180 ?)對人參皂苷Rg1和Re進行分析,得到如下結果:


                點擊查看大圖


                在藥典人參方法下,人參皂苷Rg1和Re在ChromCore 120 C18(120 ?)和ChromCore C18 (180 ?)上都能獲得良好的峰型,在ChromCore C18 (180 ?)獲得更好的分離度(R>2.0),滿足藥典要求。


                ChromCore 120 C18(120 ?)和ChromCore C18 (180 ?)兩款色譜柱采用相同的硅膠基質和鍵合工藝,主要差別在于孔徑。






                另外,2020版中國藥典西洋參的含量測定項規定的色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。


                我們再按照該方法,使用相同規格的不同孔徑ChromCore C18(180 ?)和ChromCore 300 C18 (300 ?)對人參皂苷Rg1和Re進行分析(兩種人參皂苷在ChromCore 120 C18上共流出,譜圖未放):


                點擊查看大


                在藥典西洋參方法下,人參皂苷Rg1和Re在ChromCore C18(180 ?)未獲得基線分離,而在ChromCore 300 C18 (300 ?)獲得更好的分離度,完全滿足藥典要求。


                西洋參方法中梯度斜率高于人參方法(梯度更陡),因此人參方法適用的ChromCore C18(180 ?)在西洋參方法下,無法實現Rg1和Re的基線分離。


                由此可見,在分離分子尺寸較大且結構相似的化合物時,不僅要選用合適的固定相官能團,更要注意固定相基質孔徑的選擇,以達到最佳的分離效果。



                05
                得到穩定靠譜實驗方法



                經過上面實驗的對比,最后我們選用ChromCore 300 C18 (300 ?),在中國藥典人參方法下,對7種人參皂苷進行分析:


                點擊查看大


                由以上譜圖可知,7種人參皂苷在ChromCore 300 C18 (300 ?)上都能獲得良好的峰型和分離,完全滿足HPLC定性和定量要求。


                也就是說,在人參皂苷等物理尺寸較大的化合物HPLC分析中,大孔徑固定相色譜柱有利于結構相近組分的分離。



                最后總結一下


                希望今天這個案例的梳理,能夠對你的HPLC分析方法開發工作有所啟發和幫助。

                文章素材來源:

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